Isolasi Mikroba

LAPORAN MIKROBIOLOGI PANGAN

Judul Praktikum       : Isolasi Mikroba

Topik Praktikum      : Mikroba

Praktek ke/Gol          : IV/8

Hari/Tanggal             : Jum’at/ 12 September  2014

Tujuan Praktikum    : Untuk mengetahui tentang medium, tentang cara pembuatan medium, dan tentang cara penyimpanan medium.

Tinjauan Pustaka      :

Isolasi adalah mengambil mikroorganisme yang terdapat di alam dan menumbuhkannya dalam suatu medium buatan. Prinsip dari isolasi mikroba adalah memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lainnya yang berasal dari campuran bermacam-macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan dengan menumbuhkannya dalam media padat sel-sel mikroba akan membentuk suatu koloni sel yang tetap pada tempatnya. Isolasi bakteri atau biakan yang terdiri dari satu jenis mikroorganisme (bakteri) dikenal sebagai biakan murni atau biakan aksenik. Biakan yang berisi lebih dari satu macam mikroorganisme (bakteri) dikenal sebagai biakan campuran, jika hanya terdiri dari dua jenis mikroorganisme, yang dengan sengaja dipelihara satu sama lain dalam asosiasi, dikenal sebagai biakan dua-jenis

Persyaratan utama bagi isolasi dan kultivasi fage adalah harus adanya kondisi optimum untuk pertumbuhan organisme inangnya. Sumber bakteriofage yang paling baik dan paling utama adalah habitat inang. Sebagai contoh fage koli yang di jumpai di dalam pencernaan dapat diisolasi dari limbah atau pupuk kandang. Hal ini dilakukan dengan sentifugasi atau filtrasi bahan sumbrnya dan penambahan kloroform untuk membunuh sel-sel bakterinya (Adams, 2000).

Ada beberapa cara yang digunakan untuk bakteri, fungi, dan khamir dengan metode garis, metode tuang, metode sebar, metode penuangan, serta micromanipulator. Dua diantaranya yang paling sering banyak digunakan adalah teknik cawan tuang dan cawan gores. Kedua metode ini didasarkan pada prinsip yang sama yaitu mengencerkan organisme sedemikian rupa sehingga individu species dapat dipisahkan (plezar, 2006)

Mikroorganisme dibiakkan di laboratorium pada medium yang terdiri dari bahan nutrient. Biasanya pemilihan medium yang dipakai bergantung kepada banyak faktor seperti seperti apa jenis mikroorganisme yang akan ditumbuhkan.
Perbenihan untuk pertumbuhan bakteri agar dapat tetap dipertahankan harus mengandung semua zat makanan yang diperlukan oleh organisme tersebut. Faktor lain seperti PH, suhu, dan pendinginan harus dikendalikan dengan baik  (Buckle, 2007)

Selain untuk tujuan diatas medium juga memiliki fungsi lain, seperti tempat untuk mengisolasi, seleksi, evaluasi dan diferensiasi biakan yang didapatkan. Agar tiap-tiap medium memilki karakteristik yang sesuai dengan tujuan sehingga seringkali digunakan beberapa jenis zat tertentu yang mempunyai pengaruh terhadap pertumbuhan dan perkembangbiakan mikroba (Suriawiria, 2005). Beberapa indikasi pembiakan pada laboratorium mikrobiologi meliputi:

1.     Pengasingan (isolasi) mikroba pada biakan bakteri

2.     Menunjukan sifat khas mikroba.

3.     Untuk menentukan jenis mikroba yang diisolasi dengan cara-cara tertentu.

4.     Untuk mendapatkan bahan biakan yang cukup untuk membuat antigen dan percobaan serologi lainnya.

5.     Menentukan kepekaan kuman terhadap antibiotik.

6.     Menghitung jumlah kuman

7.     Mempertahankan biakan mikroba.

Ada empat cara isolasi bakteri yaitu :

a.              Pour plate atau shake culture

Beberapa ml suspensi bakteri dicampur dengan mediaum yang masih cair (belum membeku) dengan demikian akan diperoleh piaraan adukan. Digunakan untuk mengencerkan atau mengisolasi yang terdapat pada contoh. Setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu, koloni akan tumbuh pada permukaan dan bagian bawah agar.

b.              Streak Plate atau culture

Ujung kawat imokulasi yang membawa bakteri digesekkan atau digoreskan dengan bentuk zig-zag pada permukaan agar-agar dalam cawan Petri sampai meliputi seluruh permukaan. Untuk memperoleh hasil yang baik diperlukan keterampilan, yang biasanya diperoleh dari pengalaman. Metode cawan gores yang dilakukan dengan baik kebanyakan akan menyebabkan terisolasinya mikroorganisme yang diinginkan. Dua macam kesalahan yang umum sekali dilakukan adalah tidak memanfaatkan permukaan medium dengan sebaik- baiknya untuk digores sehingga pengenceran mikroorganisme menjadi kurang lanjut dan cenderung untuk menggunakan inokulum terlalu banyak sehingga menyulitkan pemisahan sel - sel yang digores.                                                                     

c.              Slant culture

Ujung kawat yang membawakan bakteri digesekkan pada permukaan agar-agar miring dalam tabung reaksi. Dapat dilakukan dengan cara menggoreskan secaa zig-zag pada permukaan agar miring menggunakan jarum ose yang bagian atasnya dilengkungkan. Cara ini juga dilakukan pada agar tegak untuk meminimalisir pertumbuhan mikroba dalam keadaan kekurangan oksigen. (Rusdimin, 2003)  

d.             Stab culture

Ujung kawat yang membawakan bakteri ditusukkan pada media padat (agar-agar) dalam tabung reaksi, berbeda dengan slant culture permukaan agar-agar ini tidak miring. Media agar setengah padat dalam tabung reaksi, digunakan untuk menguji gerak bakteri secara makroskopis.

Karakteristik koloni bakteri hasil inokulasi merupakan salah satu bagian dalam identifikasi bakteri. Beberapa bentuk koloni spesifik koloni bakteri pada media agar datar yaitu (Sutedjo dalam Sari, 2009) :

1.      Ukuran

• Titik

• Kecil

• Sedang

• Besar

2.      Warna koloni

Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan tidak kontras dengan air, di mana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Oleh karena itu pengamatan tanpa pewarnaan menjadi lebih sukar dan tidak dapat digunakan untuk melihat bagian-bagian sel dengan teliti.

3.      Bentuk koloni

• Bundar

• Tidak beraturan

• Rhizoid (tersebar seperti akar)

4.      Bentuk bagian tepi koloni (margin )

• Rata (entire)

• Tidak rata, bergelombang secara beraturan (lobate )

• Bergelombang (undulate )

• Bergerigi (serrate )

• Seperti filamen (filamentous)

Reagen/Bahan           :

1. Bahan dalam pewarnaan gram
1. Aquades steril
2. Kristal violet (0,02 gr dalam 100 ml aquades)
3. Lugol
4. Alkohol 70%
5. Safranin
6. Makanan yang mengandung bakteri : Nata de coco

2.    Bahan pada isolasi mikroba

a.     NA/PDA

b.     Aquades

c.     Nata de coco  

d.    alcohol

e.     pepton water/NacL Fisiologis (0,85%)          

Alat                             :

1. Jarum ose
2. Kaca Preparat
3. Mikroskop
4. Cawan petri steril
5. Tabung reaksi
6. Lampu spritus

Prosedur                    :

            Untuk pewarnaan gram:

1. Bersihkan kaca preparat dengan alkohol sampai lemaknya hilang. Dan keringkan diatas lampu spiritus.
2. Ambil bahan nata de coco dengan jarum ose yang sebelumnya sudah dipanaskan diatas spiritus. Letakkan pada kaca preparat steril.
3. Tambahkan aquades steril dan homogenkan.
4. Fiksasi dengan melakukan di atas api.
5. Tambahkan kristal violet atau genta violet, biarkan 1 menit dan kemudian cuci di air yang mengalir.
6. Tambahkan lugol, biarkan 1 menit dan kemudian cuci di air yang mengalir.
7. Tambahkan alkohol 70% biarkan 10 detik dan kemudian cuci di air yang mengalir.
8. Tambahkan safranin, biarkan 30 detik dan kemudian cuci di air yang mengalir.
9. Kemudian keringkan dengan kertas saring.
10. Lakukan pengamatan dibawah mikroskop.

Prosedur untuk isolasi mikroba:

1. Siapkan tempat steril dan alat-alat yang sudah disterilkan
2. Encerkan 5 ml atau 5 gr simple (hancurkan)
3. Campurkan kedalam 45 ml Nacl fisiologis steril, kemudian homogenkan dengan memutar/diguncangkan sebanyak 25 x.
4. Ambil 1 ml dari pengenceran 1, lalu tambahkan ke tabung reaksi yang telah berisi 9 ml NacL fisiologis steril kemudian di mix. Lakukan hal yang sama sampai pengenceran.
5. Ambil 1 ml/0,1 ml sampel, kemudian tanam pada media NA dan PDA agar, secara goresan dan tuang.

-          Cara menanam secara goresan, pijarkan pipet pada Bunsen, ambil 1 ml sampel kemudian goreskan dengan jarumm ose steril secara sinambung pada lempengan agar.

-          Cara menanam secara tuang, pijarkan pipet pada Bunsen, ambil 1 ml sampel, kemudian tuangkan ke dalam cawan petri yang berisi media agar cair, biarkan agak keras.

6. Incubasi selama 24 jam dalam incubator dengan suhu 28˚ C.
7. Lanjutkan inkubasi 24 jam lagi (total 48 jam), catat apa yang terjadi.

Hasil Pengamatan     :

1.                                                                  GAMBAR: ISOLASI MIKROBA 1           2. GAMBAR: ISOLASI MIKROBA 2

Pada pengamatan/pewarnaan gram di bawah   mikroskop kami tidak menemukan gambar bakteri nata de coco. Namun, dilihat dari buku yang di kami baca, nama bakteri pada nata de coco adalah Azotobacter xilynum.

Pembahasan              :

 

 

 

Keterangan      :

1. Bersihkan kaca preparat dengan alcohol, supaya steril
2. Nyalakan lampu spiritus, dan keringkan kaca preparat yang sudah dibersihkan dengan alkohol, jangan sampai kaca preparatnya gosong.
3. Keringkan kaca preparat dengan cara membolak-balikannya.
4. Setelah kaca preparat steril, barulah diletakan sampel pada kaca preparat yakni nata de coco, dengan mengambil air nata de coco dengan ose, dan tempelkan secara transparan.
5. Tambahkan aquades steril dan homogenkan, serta fiksasi diatas api.
6. Tambahkan kristal violet atau gentan violet.
7. Genta violet diteteskan ke aca preparat.
8. Diamkan sekitar 1 menit, sambil kaca preparatnya sedikit digoyang-goyangkan.
9. Dan setelah itu cuci dengan air mengalir.
10. Selanjutnya tambahkan lugol dan teteskan ke kaca preparat.
11. Dan diamkan 1 menit.
12. Kemudian cuci di air mengalir.
13. Tambahkan alkohol 70 persen dan teteskan ke kaca preparat.
14. Diamkan 10 detik, dan cuci di air mengalir.
15. Tambahkan safranin ke kaca preparat.
16. Diamkan 30 detik dan cuci di air mengalir.
17. Keringkan kaca preparat dengan kertas saring, sampai kaca preparat benar-benar kering.
18. Dan terakhir diamati di mikroskop.
19. Pejarkan ose dalam laminar, tunggu sampai pijar.
20. Ambil sampel sedikit dengan ose dari dalam tabung reaksi yang mengandung cairan nata de coco, dan setelah itu masukkan ke tabung reaksi yang berisi NaCl.
21. Homogenkan dengan vortex.
22. Sterilkan ose dengan pijar dan ambil sampel dengan ose yang disterilkan.
23. Pindahkan smapel pada ose ke dalam cawan petri yang telah berisi nutrient agar, dengan membentuk persegi dari goresan osenya.
24. Lalu bungkus cawan petri dengan kertas A4 dan masukkan ke dalam incubator. Selama 1 hari.
25. Setelah satu hari, diamati dan di dalam nutrient agar terdapat koloni bakteri yang memiliki banyak bentuk dan warna bakteri yang berbeda-beda.
26. Sama seperti pada isolasi bakteri yang pertama, kita lakukan lagi di dalam laminar, oijarkan ose sampai steril.
27. Kemudian ambil sampel di NA cawan 1, kemudian ambil satu sampel bakteri dan pindahkan ke cawan petri yang berisi NA baru.
28. Dan goreskan ose tersebut pada NA itu, dengan bentuk persegi juga.
29. Setelah itu bungkus dengan rapi. Dan disimpan kembali di dalam incubator.

Dalam praktikum isolasi bakteri, memerlukan lingkungan dan medium yang berisi zat hara untuk pertumbuhan sel, sintesis sel, keperluan energi dalam metabolisme, dan pergerakan  yang sesuai dengan mikroorganisme. Medium biakan yang digunakan untuk menumbuhkan mikrobia dalam bentuk padat, semi padat. Yang digunakan dalam praktikum adalah medium padat yaitu agar. Agar digunakan sebagai media karena tidak dapat diuraikan oleh mikroba. Media yang digunakan dalam praktikum adalah NA  yang akan di biakan adalah bakteri. Dalam paratikum kali ini kami memakai teknik goresan. Metode goresan terdiri dari penginokulasian biakan murni dalam hal ini  digunakan Bakteri dari makanan yang sudah dibuat dalam acara 1 dengan medium NA dalam cawan petri. Mula-mula medium NA dengan suhu 45-50⁰C dituangkan pada cawa petri steril, diratakan dengan cara memutar-mutarkan cawan setelah itu biarkan hingga dingin dan memadat. Setelah medium NA padat, ambil 1 ose bakteri dari biakan murni pada acara 1 kemudian goreskan pada permukaan agar selama menggores tutup cawan dibuka secukupnya. Cara menggoreskannya yaitu awalnya cawan dibagi menjadi 4 bagian kemudian goreskan bakteri pada permukaan agar dengan dibuat zigzag menyambung dari cawan bagian ke-1 sampai ke cawan bagian ke-4 tidak terputus. Pada bagian cawan ke-4 goresan tidak boleh mengenai bagian yang pertama. Setelah diinkubasi selama 2 hari akan terlihat koloni bakteri berkumpul pada goresan-goresan tersebut. Karena pada saat penggoresan yang kurang baik, akhirnya bakteri menyebar ke semua bagian cawan. Bakteri yang dihasilkan ada bermacam-macam ukuran ada yang large dan small, dengan bentuk irregular, elevasi flat, dan margins lobate.

Kesimpulan                :

          Pengertian dari Isolasi adalah mengambil mikroorganisme yang terdapat di alam dan menumbuhkannya dalam suatu medium buatan. Prinsip dari isolasi mikroba adalah memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lainnya yang berasal dari campuran bermacam-macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan dengan menumbuhkannya dalam media padat sel-sel mikroba akan membentuk suatu koloni sel yang tetap pada tempatnya. 

Daftar Pustaka          :

Penuntun pratikum mikrobiologi pangan 2014/2015

Adams, M.R. 2000. Food Microbiology. University of Surrey. Guildford. New York

Buckle. 2007. Mikrobiologi Terapan. Universitas Gajah Mada: Yogyakarta

Plezar.2006. Dasar-Dasar-Mikrobiologi. Jakarta : UI Press

Rusdimin. 2003. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta: Pt Gramedia

Sari, Noorkomala. 2009. Teknik Isolasi

Mikroorganisme.http://www.scribd.com/doc/24589708/Teknik-Isolasi-M-O  [10 September 2014].